如何完成質(zhì)粒DNA提取實驗

在我們的細胞實驗中經(jīng)常會用到質(zhì)粒DNA，現(xiàn)在都用劑盒非常方便，而且菌體培養(yǎng)后，可以多管濃縮提取，提到的質(zhì)粒量多，可以

-20℃保存，以后用于酶切、轉(zhuǎn)化等實驗，可以提前跑個膠，只要不降解，就可以繼續(xù)用，避免每次要用，都要培養(yǎng)一遍再提取

一遍。

質(zhì)粒DNA的提取

質(zhì)粒多為一些雙鏈、環(huán)狀的DNA分子，是獨立于細菌染色體之外進行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒是進行分子生物學(xué)實驗

操作，進行遺傳工程改良物種等工作時最主要的DNA載體。

實驗步驟

1.搖菌培養(yǎng)

1）將鑒定測序正確的克隆菌液涂在LB固體平板。

2）置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12-17h，待長出菌落。

3） 滅菌15ml離心管內(nèi)加入5ml含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，編號標記。

4） 挑取單克隆菌團放置液體培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)基放置1個菌落。

5） 37℃，180rpm，振蕩培養(yǎng)過夜。

2.收獲細菌并裂解

1） 離心擴增好的菌液，按說明書將菌液重懸，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中。

2）用質(zhì)粒小量抽提試劑盒，按說明書要求提取質(zhì)粒。

3） 細菌高速離心1min,去除上清。

4）加入250ulRB溶液，振蕩器充分懸浮細菌。

5）加入250ulLB溶液。立即上下顛倒10次，使細菌裂解，室溫，放置2min。

6）加入250ulNB溶液。立即上下顛倒10次，使之充分中和，室溫，放置2min。

7）室溫，1500rpm，高速離心15min。

8）將吸附柱放入收集管內(nèi)，離心得到的上清轉(zhuǎn)移至吸附柱，室溫，15000rpm，高速離心30s。

9）棄廢液，將吸附柱放入收集管，加入700ul WB溶液到吸附柱中，15000rpm，高速離心30s。

10）重復(fù)上一操作。

11）將吸附柱放入干凈的1.5ml 離心管中，加30-50ul預(yù)熱的Elution Buffer，室溫，放置2min，高速離心1min。

12）樣品進行電泳檢測：1%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為2ul，紫外燈下觀察，最明亮的帶為超螺旋形式，可以在一定程度上表明提取質(zhì)粒的純度。

3.質(zhì)粒的純化

1）將之前提取好的質(zhì)粒放入1.5ml離心管中，加入1/10體積的3mol/L 無菌乙酸鈉溶液。

2）加入2倍體積的無水乙醇，放置于-20℃沉淀4-6h或過夜。

3）4℃，高速離心機14000rpm，離心20min.

4）棄去上清，70%乙醇洗2次。

5）空氣干燥，可置超凈工作臺干燥。

6）加200ul無菌水溶液干燥后所得沉淀，即為質(zhì)粒溶液。

7）紫外分光光度計測量質(zhì)粒濃度和產(chǎn)量。

測量OD260和OD280的值：質(zhì)粒DNA濃度=OD260×50×稀釋倍數(shù)（μg/mL）。

10個常見問題

一.時間控制問題

裂解時間太長，加入溶液P2后裂解時間不應(yīng)超過5 分鐘；吸附時間不夠；溶解時間不夠都會導(dǎo)致質(zhì)粒DNA提取實驗失敗。

二.大腸桿菌老化

建議涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進行液體培養(yǎng)。

三.質(zhì)?？截悢?shù)低

由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA 提取量低，可更換具體相同功能的高拷貝數(shù)載體。

四.溶液使用不當溶液P2、P3 在溫度較低時可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。

五.吸附柱過載

不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB 或者 ×YT 菌液體積必須

減少；若質(zhì)?；蛩拗骶欠浅８叩目截悢?shù)或生長率，則需調(diào)整LB 培養(yǎng)液體積。

六.質(zhì)粒未全部溶解

洗脫溶解質(zhì)粒時，可適當加溫或延長溶解時間。

七.乙醇殘留

漂洗液洗滌后應(yīng)離心盡量去除殘留液體，樹脂型試劑盒漂洗后應(yīng)晾干樹脂，再加入洗脫緩沖液。

八.洗脫液加入位置不正確

洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會覆蓋硅膠膜的表面達到最大洗脫效率。

九.洗脫液不合適

DNA 只在低鹽溶液中才能被洗脫。洗脫效率取決于pH 值。最大洗脫效率在pH7.0～ 8.5 間。當用水洗脫時確保其 pH 值在此

范圍內(nèi)，如果pH 過低可能性導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加暖至 60 ℃后使用有利于提高洗脫效率。

十.洗脫體積太小

洗脫體積對來回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。

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