基因敲除株的制備過程

更新時間：2025-03-26 點擊次數(shù)：250

基因敲除株的制備方法有多種，下面以 CRISPR - Cas9 技術(shù)為例，介紹基因敲除株的一般制備過程：

確定靶位點：根據(jù)要敲除的基因序列，選擇合適的靶位點。一般選擇基因的編碼區(qū)，尤其是起始密碼子附近或功能結(jié)構(gòu)域所在區(qū)域，以確保敲除后能有效破壞基因功能。
設(shè)計 gRNA 序列：針對選定的靶位點，設(shè)計特異性的 gRNA 序列。gRNA 通常長度為 20 個左右的核苷酸，需與靶 DNA 序列精確互補配對，同時要避免與基因組中其他非靶區(qū)域有高度同源性，以減少脫靶效應(yīng)。

選擇載體：挑選適合的表達載體，如常用的質(zhì)粒載體。載體應(yīng)包含能在宿主細胞中啟動 gRNA 和 Cas9 蛋白表達的啟動子，以及篩選標(biāo)記基因，如抗生素抗性基因，以便后續(xù)篩選陽性克隆。
插入 gRNA 和 Cas9 基因：將合成的 gRNA 序列和 Cas9 基因片段通過基因克隆技術(shù)插入到載體中，構(gòu)建成完整的 CRISPR - Cas9 表達載體。

轉(zhuǎn)染 / 轉(zhuǎn)化方法選擇：根據(jù)宿主細胞類型選擇合適的方法將表達載體導(dǎo)入細胞。對于動物細胞，常用的方法有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔法等；對于細菌或酵母細胞，可采用化學(xué)轉(zhuǎn)化、電轉(zhuǎn)化等方法。
轉(zhuǎn)染 / 轉(zhuǎn)化操作：按照所選方法的操作規(guī)程進行實驗，將 CRISPR - Cas9 表達載體導(dǎo)入細胞。在導(dǎo)入后，載體進入細胞并在細胞內(nèi)表達 gRNA 和 Cas9 蛋白，gRNA 引導(dǎo) Cas9 蛋白識別并結(jié)合到靶基因位點。

初步篩選：利用載體上的篩選標(biāo)記基因進行初步篩選。例如，使用含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，只有成功導(dǎo)入表達載體并表達出抗性蛋白的細胞才能存活，從而得到初步篩選的陽性細胞克隆。
鑒定陽性克隆：通過 PCR 擴增靶基因區(qū)域，然后進行測序分析，確定是否在靶位點發(fā)生了基因編輯。只有在靶位點出現(xiàn)堿基缺失、插入或替換等突變，導(dǎo)致基因功能喪失的克隆，才是真正的基因敲除陽性克隆。

單克隆分離：采用有限稀釋法或軟瓊脂平板法等，將篩選出的陽性細胞克隆進行單細胞分離培養(yǎng)，得到單個細胞衍生的克隆群體，確保每個克隆均來自單個基因敲除細胞。
進一步鑒定：對單克隆細胞進行再次鑒定，除了通過測序驗證基因敲除情況外，還可采用 Western blot、免疫熒光等方法檢測基因敲除后蛋白表達水平的變化，以確認基因敲除的效果。

胚胎注射：如果要制備基因敲除動物模型，如小鼠，可將 CRISPR - Cas9 系統(tǒng)注射到受精卵中。通過顯微操作技術(shù)，將含有 gRNA 和 Cas9 蛋白或 mRNA 的溶液注射到受精卵的原核或細胞質(zhì)中，然后將注射后的受精卵移植到代孕母鼠的輸卵管中，讓其發(fā)育成胚胎。
基因敲除動物鑒定：待幼鼠出生后，通過提取鼠尾基因組 DNA，采用 PCR 和測序等方法鑒定基因敲除情況，篩選出基因敲除陽性的動物個體，即得到基因敲除株動物模型。
雅吉生物細胞庫依托上海細胞庫天然優(yōu)勢，專業(yè)提供細胞技術(shù)服務(wù)。細胞質(zhì)?；蛘T導(dǎo)表達，穩(wěn)定細胞株pool，單克隆穩(wěn)定細胞株篩選，藥篩基因去除，誘導(dǎo)性表達質(zhì)粒構(gòu)建，轉(zhuǎn)基因表達鑒定，包括：基因敲入/敲除，常規(guī)基因穩(wěn)轉(zhuǎn)、Luc1/2，誘導(dǎo)性表達，基因敲入/敲除，常規(guī)基因穩(wěn)轉(zhuǎn)、Luc1/2、誘導(dǎo)性表達，基因原位敲入/敲除，Cre轉(zhuǎn)染、單克隆篩選、藥篩基因去除鑒定等。更多細胞技術(shù)服務(wù)項目周期及報價咨詢客服