實時熒光探針PCR技術，又稱為qPCR，是一種結合了PCR擴增和熒光檢測的分子生物學技術。它能夠在PCR反應進行的同時，實時監(jiān)測特定DNA序列的擴增情況。該技術主要依賴于熒光標記的探針，這些探針能夠特異性地結合到目標DNA序列上。

在PCR循環(huán)中，隨著目標DNA的指數(shù)級擴增，熒光信號也相應增強。熒光信號的強度與擴增產(chǎn)物的量成正比，因此可以通過熒光信號的變化來實時監(jiān)測PCR反應的進程。實時熒光探針PCR技術通常使用兩種類型的熒光探針：TaqMan探針和SYBR Green。

SYBR Green是一種DNA染料，它能夠非特異性地結合到雙鏈DNA上，具有使用簡便，價格便宜等優(yōu)點而被廣泛使用。但其最大的缺點是缺乏特異性，即染料可以與任何dsDNA結合。因此，qPCR反應中有非特異性擴增產(chǎn)物的出現(xiàn)會增加熒光值，影響定量結果的準確性，而TaqMan探針法的出現(xiàn)很好地解決了染料法非特異性的問題，這也讓TaqMan探針法在檢測領域大放異彩！接下來，就讓我們了解一下TaqMan探針法qPCR在支原體檢測方面的應用。

TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，它含有一個熒光報告基團和一個淬滅基團。當探針完整時，報告基團發(fā)出的熒光被淬滅基團吸收。在PCR擴增過程中，TaqMan探針與目標DNA序列結合，Taq DNA聚合酶的5'到3'外切酶活性會切割探針，導致報告基團和淬滅基團分離，從而發(fā)出熒光信號。切割的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比，因此，通過檢測PCR反應體系中的熒光強度可以達到檢測PCR產(chǎn)物擴增量的目的。

檢測機制與定量分析?

根據(jù)檢測方式不同，PCR試劑盒分為?常規(guī)PCR?和?實時熒光定量PCR?兩類：

常規(guī)PCR檢測

擴增后通過瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物大小，定性判斷目標片段是否存在。

實時熒光定量PCR（qPCR）

熒光標記?：加入熒光探針（如TaqMan探針）或DNA結合染料（如SYBR Green）；

信號監(jiān)測?：每輪擴增后實時檢測熒光強度，通過?t值（熒光達到閾值所需循環(huán)數(shù)）定量起始模板量；

標準曲線法?：利用已知濃度的標準品建立Ct值與模板濃度的線性關系，計算樣品濃度

探針法qPCR在支原體檢測中的應用

引物設計

針對支原體16S rRNA序列，下載后進行序列比對，篩選支原體特異性的區(qū)段，尋找兩端特異中間保守的區(qū)段，設計引物。一般選擇多對正反向引物，和多條相對應的探針引物。

內參設計

同時為了保證實驗的有效性和穩(wěn)定性，往往還會設計一對內參引物和內參熒光探針，用于監(jiān)控每次反應過程的穩(wěn)定性。

反應模板

檢測時需取培養(yǎng)至少2~3天的細胞培養(yǎng)物，進行核酸提取后，作為模板進行qPCR反應。

目前市場上優(yōu)秀的qPCR支原體檢測試劑盒可檢測支原體種類可達到39~180種以上，檢測靈敏度可達到10cfu/mL。

1高特異性：TaqMan探針通過與目標DNA序列特異性結合，確保了檢測的高特異性。

2高靈敏度：該方法可以檢測極低濃度的核酸模板，靈敏度高。

3實時監(jiān)測：在PCR反應過程中實時監(jiān)測熒光信號，可以準確地定量分析。

4減少污染風險：由于不需要后續(xù)處理，減少了PCR產(chǎn)物污染的風險。

多重檢測能力：可以同時使用不同顏色的熒光標記，進行多重檢測。

5簡化操作：制作成預混液后，大大簡化操作步驟，易于標準化和自動化。TaqMan探針法qPCR應用于支原體檢測的優(yōu)點