RAPA3G SYBR Green qPCR Mix試劑本制品是采用 SYBR Green 嵌 合 熒 光 法 進 行

Real-Time PCR 的專用試劑，本 SYBR Green qPCR Mix

將化學(xué)修飾的熱啟動 RAPA3G DNA 聚合酶、反應(yīng) Buffer、

dNTP、SYBR Green 染料等試劑預(yù)混在一起，是一種 2×濃

度的單組分預(yù)混試劑。該制品配有單獨的 ROX 內(nèi)參染料，

可用于需要 ROX 進行孔間校正的定量 PCR 儀。

RAPA3G DNA 聚合酶為第三代 DNA 聚合酶，其具有最

高的雜質(zhì)耐受性（對乙醇、胍鹽、肝素具有的耐受性），

因此對于純度較差的 DNA 模板，該 Mix 仍然可以獲得理想

的實驗結(jié)果。RAPA3G DNA 聚合酶為化學(xué)法修飾的 HotStart

版本，其在 50℃以下 100%無活性，只有 95℃條件下加熱

5min 后才能恢復(fù)酶的活力。因此該系統(tǒng)可以有效抑制

非特異性 PCR 擴增，極大的提高了 PCR 擴增特異性。該試

劑盒的反應(yīng)緩沖液，可在寬范圍中得到良好的擴增結(jié)

果、檢測靈敏度更高、信號更強。

包裝

規(guī) 格

2×RAPA3G SYBR

Green qPCR Mix

50×ROX Dye

1ml （A2250A） 1 ml 200 μl

5ml （A2250B） 1 ml×5 200 μl

儲存：

請避光置于-20℃以下可保存３年。該試劑經(jīng) 30 次凍融后性

能無下降，因此不使用時請置于-20℃避光保存。操作方法

1. 根據(jù)機型選擇步驟 A 或 B

A: 需要添加 ROX 染料進行反應(yīng)孔間信號矯正的 Real-Time

PCR 儀，包括：ABI PRISM7900HT, 7300/7500/7500 Fast

Real-Time PCR (Applied Biosystems)；Mx3000P

(Stratagene)等。按照如下組分配制 20 μl PCR 反應(yīng)體系：

 終濃度

2×RAPA3G SYBR Green qPCR Mix 10 μl 1×

50×ROX Reference Dye 0.4 μl 1×

PCR Forward Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM

PCR Reverse Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM

DNA 模板 0.5~2 μl

ddH2O Up to 20 μl

注意：引物用量有時可提高到 0.8 μl 以提高擴增效率。

B:無需添加 ROX 染料進行反應(yīng)孔間信號矯正的 Real-Time

PCR 儀，包括：LightCycler (Roche Diagnostics)； CFX96

Real-Time PCR(Bio-Rad & MJ)；Line-Gene(Bioer，杭州博

日)等。按照如下組分配制 20 μl PCR 反應(yīng)體系：

 終濃度

2×RAPA3G SYBR Green qPCR Mix 10 μl 1×

PCR Forward Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM

PCR Reverse Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM

DNA 模板 0.5~2 μl

ddH2O Up to 20 μl

2. 進行 Real-Time PCR 反應(yīng),通常采用兩步法，程序如下：

 Stage 1: 95℃ 5min*

 Stage 2: 95℃ 10s

60℃ 20s 40 cycles

 Stage 3: Dissociation analysis

注意：由于該酶為化學(xué)修飾的熱啟動 RAPA3G DNA 聚合酶，必須于 95℃

加熱 5min 才能恢復(fù)酶的活性，該熱啟動步驟不能縮短時間。

3. 反應(yīng)結(jié)束后確認 Real-Time PCR 的擴增曲線、融解曲線

和標(biāo)準曲線。R

恒溫擴增使用策略及實例展示

應(yīng)用實例1：A3825-01 紅黃變色反應(yīng)（肉眼觀察）

以 體外轉(zhuǎn)錄 RNA 為模板，1-6分別為1、10 、100、1000、104和106Copy，NTC為ddH2O為模板。 上圖為加樣結(jié)束反應(yīng)起始前，下圖為 65 度反應(yīng) 30min 后。

應(yīng)用實例2：在以A3824-03或 A3828-03，用 LP1002引物組進行的LAMP測試。Bst4.0 SYBR Green試劑可在標(biāo)準定量PCR儀或恒溫?zé)晒鈨x上進行反應(yīng)。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應(yīng)25min的檢測結(jié)果，可以看到檢測反應(yīng)<20min(達平臺期)。

應(yīng)用實例3： 用 LP1002引物組進行的LAMP測試。OG變色法為終點變色策略，在反應(yīng)結(jié)束后，倒置反應(yīng)管，溶解管蓋上染料后，陽性樣本呈現(xiàn)出醒目的綠色，陰性表現(xiàn)出橙色，區(qū)分明顯。且該方法不受樣本類型限制，雜質(zhì)耐受性很好。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應(yīng)20min后檢測結(jié)果。

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